5. 培养箱内孵育一定时间后测定 450nm 吸光度 ，制作出一条以细胞数量为横坐标(X 轴) ，吸光度为纵坐标(Y 轴)的标准曲线。 根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量（使用此标准曲线的前提是实验的条件要一致 ，便于确定细胞的接种数量以及 加入 CCK-8 后的培养时间。）
细胞活性检测
1. 制备细胞悬液：细胞计数。
2. 接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数，每孔约100μl 细胞悬液，可设置3个重复孔。
3. 37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养2-4 小时，如果不需要贴壁，这步可以省去。
4. 每孔加入10μl CCK-8增强型溶液：由于每孔加入CCK-8 量比较少，有可能因试剂沾在孔壁带来误差 ，建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。或者直接配置含10% CCK-8 的培养基，以换液的形式加入。注意不要在孔中生成气泡，以免影响吸光度的检测。
5. 培养箱内孵育0.5-4 小时：细胞种类不同，形成的 Formazan 的量也不一样，对于大多数情况孵育 1 小时即可。如果显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件。特别是血液细胞形成的 Formazan很少，需要较长的显色时间（5-6 小时）。
6. 测定450nm 吸光度：如果暂时不测定吸光度，可以向每孔中加入10μl CCK-8 反应终止液，遮盖培养板避光保存在2-8℃，在 7 天内吸光度不会发生变化；或者可以向每孔中加入10μl 配制的 0. 1M HCl 溶液或 1% w/v SDS 溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下，在 24 小时内吸光度不会发生变化。
细胞增殖-毒性检测
1. 制备细胞悬液 ：细胞计数。
2. 接种到 96 孔板中 ：根据合适的铺板细胞数 ，每孔约 100μl 细胞悬液 ，可设置 3 个重复孔。
3. 37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养 2-4 小时，如果不需要贴壁，这步可以省去。也可以根据实验要求的不同， 培养相应的时间。
4. 每孔加入 0- 10μl 不同浓度的待测药物。
5. 37℃培养箱中培养 ：加入待测药物的培养时间 ，要看该物质的性质和细胞的敏感性 ，一般要根据细胞周期来决定 ，起码要一 代以上的时间。
6. 每孔加入 10μl CCK-8 增强型溶液 ：由于每孔加入 CCK-8 量比较少 ，有可能因试剂沾在孔壁带来误差 ，建议在加完试剂后轻 轻敲击培养板以帮助混匀。或者直接配置含 10% CCK-8 的培养基 ，以换液的形式加入。注意不要在孔中生成气泡 ，以免影响吸光度的检测。（注意 ：如果待测物质有氧化性或还原性的话 ，可在加 CCK-8 之前除去培养基 ，并用培养基洗涤细胞两次 ，然后 加入新的培养基 ，以去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下 ，可以不更换培养基 ，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。）
7. 培养箱内培养 0.5-4 小时 ：细胞种类不同 ，形成的 Formazan 的量也不一样 ，对于大多数情况孵育 1 小时即可。如果显色不够的话 ，可以继续培养 ，以确认最佳条件。特别是血液细胞形成的 Formazan很少 ，需要较长的显色时间（5-6 小时）。
8. 测定 450nm 吸光度 ：建议采用双波长进行测定 ，检测波长 450-490nm ，参比波长 600-650nm。如果暂时不测定吸光度 ，可 以向每孔中加入 10μl CCK-8 反应终止液 ，遮盖培养板避光保存在 2-8℃ , 在 7 天内吸光度不会发生变化；或者可以向每孔中加 入 10μl 配制的 0. 1M HCl 溶液或 1% w/v SDS 溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下，在 24 小时内吸光度不会发生变 化。
计算公式
细胞存活率 = [(As - Ab)／(Ac - Ab)] × 100%
抑制率 = [(Ac - As)／(Ac - Ab)] × 100%
As：实验孔（含有细胞的培养基、CCK-8、待测药物）的吸光度
Ac：对照孔（含有细胞的培养基、CCK-8、没有待测药物）的吸光度
Ab ：空白孔（不含细胞和待测药物的培养基、CCK-8） 的吸光度
保存条件
4 ℃避光保存 ，一年有效。-20 ℃可以储藏更久 ，但反复冻融会增加背景值 ，干扰实验测定 ，因此请将经常使用的试剂保存在4 ℃。
注意事项
1. 建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入 CCK-8 试剂后的培养时间。
2. CCK-8 反应时间的确定 ：一般情况下 ， 白细胞显色比较困难 ， 因此需要增加细胞数量和延长 CCK-8 反应时间。悬浮细胞与贴壁细胞相比较难显色 ，因此悬浮细胞在加入 CCK-8 培养 0.5-4 小时后 ，可先从培养箱取出 ，目测或用酶标仪测定显色程度 ，若显色困难可以继续培养数小时后再确定。对于贴壁细胞 ，CCK-8 的培养时间一般为 0.5-4 小时，在培养 20 分钟左右即可取出肉眼观察显色程度。
3. 每孔接种细胞数 ：当使用标准 96 孔板时 ，贴壁细胞的最小接种量至少为 1000 个/孔 (100 μl 培养基)。检测白细胞时的灵敏 度相对较低，因此推荐接种量不低于 2500 个/孔 (100 μl 培养基)。如果要使用 24 孔板或 6 孔板实验，请先计算每孔相应的接种量 ，并按照每孔培养基总体积的 10%加入 CCK-8 溶液。
4. 设定空白对照 ：在不含细胞的培养基中加入 CCK-8 ，培养一定的时间 ，测定 450 nm 的吸光度即为空白对照。在做加药实验（细胞毒性实验）时 ，还应考虑药物的吸收 ，可在加入药物的培养基中加入 CCK-8 ，培养一定的时间 ，测定 450 nm 的吸光度作为空白对照。
5. 影响 CCK-8 测定的物质： 由于 CCK-8 检测细胞活性的原理是通过检测活细胞脱氢酶催化的反应，所以如果待测体系中存在氧化还原物质则可能会干扰检测结果，还原性物质会使吸光度增加，氧化性物质会使吸光度减小， 因此应需设法去除这些物质的影响。酚红和血清对本试剂盒的测定无明显影响 ，培养基中酚红的吸光度可以在计算时 ，通过扣除只含有培养基的对照孔中本底吸光度而消除 ，因此不会对检测结果造成影响。
6. 测定波长 ：如果样品为高浑浊度的细胞悬液 ，建议采用双波长进行测定 ，检测波长 450nm ，参比波长 600-650nm。如果没有 450nm 的滤光片 ，可以使用吸光度在 430-490nm 之间的滤光片 ，但是 450nm检测灵敏度最高。
7. 当在培养箱内培养时 ，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发 ， 由于体积不准确而增加误差。一般情况下 ，最外一圈的孔只加培养基 ，不作为测定孔用。
8. 如果细胞培养时间较长 ，培养基颜色发生变化 ，应洗涤细胞更换培养基后再加 CCK-8 检测。
9. 为了您的安全和健康 ，操作时请穿着实验服并佩戴一次性手套。
EN 
